顯微鏡光源及使用要點

　　1.1 光源

　　在很多舊的顯微鏡書上所提到在理想的照明光源外有一層白色的遮蔽保護(hù)，而現(xiàn)在所使用的為電子照明。如果沒有完整的照明系統(tǒng)內(nèi)建在顯微鏡里，光源通常為一個電網(wǎng)電壓玻璃電子燈泡裝置在一個簡單的外罩里，跟顯微鏡的鏡子一起使用。這一類型的照明并不完全適合在高功率下所使用，因為這一型的照明很大臺、會制造大量的熱而且只有很低的照明。如果有外部照明使用，外罩就不需要一塊收集鏡但是光源必需裝設(shè)一個合適的虹膜光圈或是有不同大小的金屬光圈設(shè)備。當(dāng)顯微鏡使用光源集中模式時，將有適合的場光圈和控制照明的大小。如果有一個可聚焦收集鏡安裝在外部燈泡，將可以使用科勒照明。一些比較便宜的顯微鏡裝有低功率、低瓦數(shù)燈泡，燈泡里頭的燈絲設(shè)計的較平，將線圈緊密的纏繞在一起而且面對燈泡的玻璃覆蓋的末端。這些是提供光來源的延伸。使用這一類型燈泡的顯微鏡有一片簡單的收集鏡，通常還有一片放在底面的毛玻璃來提供光的散射。雖然光燈泡是放置在顯微鏡的基座，照明設(shè)備可預(yù)先校準(zhǔn)且顯微鏡在光源集中模式下可使用。很多實驗用的顯微鏡有相同的類型的低電壓燈泡，放置在前中心平臺，此平臺可以隨著我們所需要去移動，制造出我們所想要的光源。

　　2.1燈絲的分類

　　鎢絲燈泡的動力來源主要是經(jīng)由電壓控制變壓器。燈泡發(fā)散出連續(xù)的光譜，從300到1500nm，大部份的能量輸出都在長波長的范圍里。這表示光有相對低的色溫。當(dāng)照射器的電壓上升，照射器的發(fā)光及色溫也一起很明顯的增加。光源的色溫在色彩顯微照相術(shù)里很重要，他的單位為K。

　　傳統(tǒng)燈泡的缺點就是他的輸出會隨著使用的時間而衰減，像鎢會從燈絲上蒸發(fā)然后冷卻凝結(jié)在燈泡玻璃內(nèi)側(cè)使得玻璃變黑。

　　現(xiàn)在很多顯微鏡都裝設(shè)鹵素?zé)襞�，跟傳統(tǒng)的鎢絲燈泡相比，當(dāng)操作在相同的電壓下，鹵素?zé)襞萦泻艽蟮牧炼�、很高的色溫。一些鹵素?zé)襞蓦m然很小，但是在12伏特之下可輸出100瓦的功率。以鹵素?zé)襞輥碚f，在硅玻璃外罩下的燈絲非�？拷�，這樣可以產(chǎn)生很高的燈絲溫度，所以一般的玻璃無法承受這樣的溫度。鹵素?zé)襞莸母邿艚z溫度可以產(chǎn)生很高的照明。鹵素?zé)襞萘硪环N的特征就是硅玻璃不會隨著使用的時間而變黑。這一類型的燈泡即使長時間使用，光的輸出很明顯的不會改變，然而色溫卻會隨著燈泡使用的時間會有一些減少。鹵素?zé)襞菀粯影l(fā)射出連續(xù)頻譜，當(dāng)操作在相關(guān)的電壓下，色溫的范圍大約是在3200-3250K。由此可裀鹵素?zé)襞菀恢倍荚诟邷叵虏僮�，所以在光路徑必需裝有一片濾熱鏡，而且鹵素?zé)襞菀�安裝在通風(fēng)良好的燈屋里。

　　當(dāng)聚光鏡將明場圖像聚在樣品面上，在工作臺下方的聚光鏡嵌合口，必須用一些方法將顯微鏡的光軸導(dǎo)向中央，幾乎所有的聚光鏡都有光圈在焦平面或靠近焦平面的地方，這種光圈是照光孔徑光圈(光圈孔徑是適合短工作距離的)，它還限制了NA值，透過聚光鏡，使圓錐光線不致于發(fā)散而且適合物鏡的孔徑，在舊的儀器上通常會提供彩色濾光片的嵌合口，以提高對比值，或色彩溫度校正。

　　1.3 聚光型式

　　雙鏡片照明器的聚光鏡較常使用在便宜的顯微鏡，由Ernst Abbe設(shè)計，在圖6.2a有展示出，這種聚光鏡對于色彩和球面像差沒有修正，所以不適合用高質(zhì)量的顯微鏡，Abbe聚光鏡在光圈全開的時候產(chǎn)生圓錐型的光線，所以不會產(chǎn)生敏銳的聚焦(因為球面像差的關(guān)系)，而是產(chǎn)生一個多重焦點的混亂區(qū)域(顯示在圖1.13)，這代表由Abbe聚光鏡所產(chǎn)生的影像不是那么的清析，而且在周圍有彩色的光環(huán)(因為此種聚光鏡缺少色彩調(diào)校)，一個典型的Abbe雙鏡片照明器，利用’dry’，有最大的孔徑約0.5，Abbe最主要的好處是便宜和有很長的工作距離，而且有能力在物體上照亮很大的范圍。

　　能得到高校正的聚光鏡是比較好的結(jié)果，三鏡片Abbe聚光鏡或等光程聚光鏡，有比一般Abbe聚光鏡好的球面像差校正，不過仍然對色差沒有改善，有一種’dry’NA值為0.65的油涂在載玻片底下，當(dāng)它的孔徑值達(dá)到1.2的時候，不管色差，這類型的的聚光鏡常用在一般的顯微鏡上，最貴的無色差/等光程聚光鏡(圖6.2c)在最少兩個波長下適當(dāng)?shù)娜旧�，�?dāng)載玻片涂上油，聚光鏡可以提供圓錐狀的等光程光線，其NA值約為1.4，某些聚光鏡為了獲得最高的解析，使用高數(shù)值孔徑且復(fù)消色差的浸油型物鏡。

　　1.4 光源聚焦

　　控制樣品的照明是基本的工作，操控光源照明確�？傻玫竭m宜觀測結(jié)果，這些控制包含有樣品的照明及限制樣品中所需照明的區(qū)域，使光源照只射于樣品某區(qū)域中使其可見是一個很好的練習(xí)，這可減少因散射強(qiáng)光降低圖像對比。

　　這幾年中，安排照明器及聚光鏡方式已滿足目前的需求，這老式方法稱為”光源聚焦”的照明，在近幾個世紀(jì)中已使用燃燒的油燈來達(dá)到光源聚焦的目的�，F(xiàn)今，光源聚焦的照明方式仍廣泛的使用于廉價的學(xué)生顯微鏡及利用額外的照明設(shè)備觀測的業(yè)余使用者，像opal enlarger 燈泡這樣的均勻光源，直接經(jīng)由聚焦鏡將光源聚于樣品面上，而樣品中被照明的區(qū)域是由位于照明器前方的照明光圈所控制的，一系列的共扼面將使得照明器表面、場光圈及樣品聚焦于同一處，致使以上的影像將呈現(xiàn)于視網(wǎng)膜，為了改善這樣的情況，照明的設(shè)備必需足夠大、無明顯的結(jié)構(gòu)外型及在照明器表面具有均勻的光強(qiáng)度，當(dāng)額外的照射光源必需使用時，光源聚焦的照明方式將適合于平�？梢姷娘@微鏡系統(tǒng)，這樣的設(shè)置是即簡單又容易。

　　大多數(shù)近代的顯微鏡都使用低電壓白熾燈或是鎢絲鹵素?zé)糇鳛檎彰髟O(shè)備，由于鎢絲照明器具有顯著的結(jié)構(gòu)，這使得無法用于光源聚焦的模式;然而，起初用于顯微照相術(shù)由August Kolher所發(fā)明的技術(shù)卻可用來取代，這是一種將鎢絲燈置于集光鏡后方之焦距處，而場發(fā)光光圈掛載于集光鏡前方，如此一來顯微聚光鏡可將場發(fā)光光圈處之影像聚焦于待測樣品平面上，然而集光鏡只將鎢絲照明器影像投射于聚光鏡前的焦平面上(也就是光圈虹膜所在位置)，因此照明器的影像將只會出現(xiàn)”光圈圖表”的共扼面上，也就表示我們將不會再看到燈絲影像了。在這樣的設(shè)置中，照明設(shè)置中的集光鏡如同照射在樣品平面上均勻的第二照射光源，這么一來似乎具備了可調(diào)整光源大小的均勻照明器;場光圈及樣品的影像將會接替出現(xiàn)于”場圖表”中的共扼面上，我們稱為主要影像平面，并且會成像于視網(wǎng)膜上。

　　對(Kölher)科勒照明而言，照明燈箱必需符合集光鏡，通常包含了非球狀的組件，這樣的集光鏡系統(tǒng)必需能具足夠的擴(kuò)大投射白絲燈影像，使得聚光鏡的最大工作光圈充滿了光源，在Kölher系統(tǒng)中光圈是符合集光透鏡的，并作用為場照明光圈，這個動作，第一是為修改物體所受照明區(qū)域的直徑，由于樣品受光學(xué)場以外的光影響導(dǎo)致散射光進(jìn)入物鏡中，并且自主要影像周圍所造成的光在鏡管中散射至目鏡，除非我們將場照明光圈影像限制在合適的觀測大小范圍;第二，當(dāng)將光圈部份關(guān)閉時，這可使得聚光鏡完成聚焦動作，并且確認(rèn)聚光鏡置于中心處，當(dāng)聚光鏡聚好焦時，場光圈影像亦同時清楚地顯示，如樣品影像清晰的位于觀測中心。

　　1.5表面照明

　　假如樣品太厚導(dǎo)致光線透不過去，如光澤的金屬塊，或它們的顏色非常深，然后必須用入射光檢查其表面，我們通常稱表面照明，最簡單的型式，用一兩個低能量的點照明燈座，在顯微鏡工作臺上方傾斜一個角度，或使用自然光傾一個角度打在樣品上，高能量的復(fù)合式顯微鏡對于光的要求必須更為嚴(yán)格，這樣才能獲得更佳的數(shù)據(jù)，有表面照明的顯微鏡，當(dāng)光由適當(dāng)?shù)慕嵌壬淙牍茏觾?nèi)的光軸，然后經(jīng)由物鏡里半穿透半反射且與光成45度的鏡片反射到樣品上，在一些較古老的顯微鏡，可以用簡單的方法達(dá)到此目的，這種顯微鏡包含一片很薄的玻璃片，通常這種玻璃類似很小的圓蓋玻片，然后在其上部份鍍銀，另一種不同的方法是使用較小且在背面有焦平面的棱鏡，當(dāng)入射光打到樣品上時會有一個小小的斜向角度，以致于物鏡的數(shù)值孔徑會減小，現(xiàn)代的系統(tǒng)使用狹縫光束盒，而且允許全彩的Kohler光來射在樣品上，如上面所說的傳送光，表面照明也可使用斜向光來應(yīng)用在明場和黑暗的環(huán)境。

　　現(xiàn)代的反射光照明設(shè)備接替鏡是一個包含了一系列的光學(xué)照明系統(tǒng)，這個用燈絲投射影像到光圈孔徑平面，這兩個的圖像靠鏡片L2投射到物鏡后方的焦平面，這就是傳送光系統(tǒng)里的光線收集鏡片，我們可以透過開關(guān)光圈孔徑來控制光通過的量，且不會影響到物鏡里鏡片的孔鏡，同時也顧及到從樣品打回來的光，如果光圈孔徑完全放在物鏡后方的焦平面，這個獨立的校正是不可能的。

　　許多應(yīng)用在生物上的顯微鏡包括了營光顯微鏡和共焦顯微鏡，這兩者通常配有表面照明設(shè)備，而且發(fā)射的光通常都是低強(qiáng)度的且往往都有最大的解析，這種顯微術(shù)也可用于低反射的物質(zhì)如煤，這些全部需要物鏡片最大的開口值，這個照明場的光圈嵌在里面，所以物鏡投射它的影像到樣本上，為了減少低反射樣品上的輝度，控制好照明場的在表面照明范圍的大小比輸送光來的重要，值得注意的是，Kohler反射光系統(tǒng)，在相對位置和光圈孔徑都與光源相反，光圈孔徑開始接近光，因為它不是形容物鏡后方焦平面的光圈位置(這樣會限制圖形的孔徑)，光圈被放置在預(yù)定的共厄面。

　　2 練習(xí)使用顯微鏡

　　2.1 得到好的影像

　　如果不幸使用質(zhì)量較差的顯微鏡，它提供的影像不是我們想要的，正確的架好儀器是非常簡單的，而且有能力提供好的影像，如果按照某種簡單的規(guī)則去調(diào)雷射，只需要很短的時間就可以獲得高質(zhì)量的影像，詳細(xì)研究顯鏡的樣本會花很多時間，這是一個很好的想法，在開始研究之前，我們要先確定椅子夠高可以讓我們舒服的觀看顯微鏡的目鏡，而不需伸長脖子或彎腰，我們可以安置我們的手在工作臺上，這可以讓我們輕易移動顯微鏡臺也可以容易對焦。

　　顯微鏡有許多控扭在使用，要在一本書里詳細(xì)介紹每個操作指令是不可能的，使用者應(yīng)該咨詢其它顯微鏡的操作手冊以了解某操作的特定用法，下面的操作指令提供讀者一個廣義的概要和使用傳送光和Kohler光基本的典型顯微鏡架設(shè)方法。

　　(1) 放置一個高對比的染色樣品在工作臺上，調(diào)整顯微鏡直到物鏡10x或16x的位置上而且打開光，打開所有的光圈，且將聚光鏡提升到最高。

　　(2) 假如顯微鏡是雙眼式的，檢查目鏡管間的雙眼距離，必要時需要重新調(diào)整。

　　(3) 粗糙的調(diào)整聚焦在樣本上，這是非常好的做法讓第一次物鏡在載玻片上5mm處，從工作臺的來看。從目鏡看過去，增加物鏡與樣品間的距離直到影像清析為止，做最校正以達(dá)到顯微鏡最好的聚焦。

　　(4) 假如你在使用雙眼式顯微鏡，你必須調(diào)整自己適合的目鏡模式，最后，目鏡必須有自己的校正環(huán)，閉上一只眼睛來調(diào)整目鏡，用另一只眼睛來對焦以取得最佳的影像，再將兩只眼睛角色互換，重復(fù)上述步驟。

　　(5) 檢查光圈孔徑是否夠?qū)挘�部份地靠近光場直到圖像呈現(xiàn)在視野里(有時候在中間圖像是模糊的)。

　　(6) 調(diào)整聚光鏡的聚焦使圖像和光場光圈合適，如果是Abbe聚光鏡，這很有可能使圖形帶有色彩，不可避免的，等光程和無色差的聚光可以提供影像和光圈場更合適。

　　(7) 如果需要，將圖像擺在光圈光場中央，這可以很簡單的在視野里讓圖像倍率和光圈場相符合，在大多數(shù)的照明系統(tǒng)設(shè)備上包括光圈，在制造的時候就已經(jīng)用聚光鏡中央的旋扭將圖形場調(diào)到中間，在某些情況下須用自己的旋扭來校正。

　　(8) 打開照明場光圈直到整個視野都照亮為止。

　　(9) 移開其中一個目鏡，然后注視物鏡后方的焦平面，假如放大鏡提供相位對比，對于看清楚焦平面是非常有用的，關(guān)掉聚光鏡的照明孔徑直到圖像超出焦平面的光場。

　　(10) 把物鏡放回原處，用亮度調(diào)整扭調(diào)整光的亮度到舒服的程度或在光徑加入自然濾片。

　　現(xiàn)在顯微鏡可以提供它能力范圍內(nèi)最好的圖像，假如物鏡沒有調(diào)整的很好，必須關(guān)上燈光，重新調(diào)整，這比獲得良好的影像來的重要，對于舊的鏡片，甚至用其它倍率來減少物鏡的工作孔徑，只有實驗經(jīng)驗才是這個情況最好的響導(dǎo)。

　　2.2 較高倍率物境：

　　低倍物鏡與高倍物鏡最大的不同是后者具較高數(shù)值孔徑及較大解析，亦指當(dāng)由較小倍率換至較大倍率時，需將光圈打開已得到較大之光錐角并得到足夠的解析。每個物鏡應(yīng)操作在光錐角為數(shù)值孔鏡的70-90%，否則會使影像不清及出現(xiàn)光暈。調(diào)回低倍物鏡時亦須重新校正，否則會造成炫光而降低對比。

　　2.3 運用極低倍物鏡：

　　應(yīng)該盡量于低倍率下觀測，如此較能使得觀測者能連結(jié)該影像至肉眼及放大鏡影像，只有當(dāng)所有信息揭取得后方能換至較大倍率物鏡，初學(xué)者大都很快及運用高倍物鏡而導(dǎo)致無法了解物體結(jié)構(gòu)，當(dāng)用低倍物鏡時通常聚光鏡無法照亮整個結(jié)構(gòu)，所以必須使用特殊適合的聚光鏡。

　　2.4 油鏡：

　　用于結(jié)構(gòu)大小約等于物鏡分辨率時必須使用數(shù)值孔徑大于1的油鏡，步驟如下：

　　1. 先使用低倍物鏡，將物體至于中央。

　　2. 先滴一滴油至蓋玻片，若使用近焦物鏡，緩慢移動物鏡接觸油。

　　3. 調(diào)整焦距至影像清晰。

　　4. 確認(rèn)聚光鏡的光圈是打開的，此時聚光鏡的最大使用數(shù)值孔徑是1.0，故光錐角是絕對不夠的，需使用特別的高數(shù)值孔徑聚光鏡。

　　最好的結(jié)果是只有要觀測樣本的部分需要被照明，當(dāng)倍率增加時，照明的范圍亦須減小，否則炫光會影響影像，特別是反射式。另一種影響影像的是泡泡，當(dāng)目鏡移去時可看到，可利用前后移動或旋轉(zhuǎn)玻片去除泡泡的影響，當(dāng)如此都無法去除時就要重滴一滴油。

　　2.5 暗視野：

　　暗視野是用來增加對比的很有價值的技術(shù)，而且簡單。此處提及暗視野基于其簡單且常受顯微學(xué)家的重視。在低倍率時通常在阿貝聚光鏡中央置一不透明之黑點，在高倍率時則需要特別之暗視野聚光鏡，且須于下方與玻片的油接觸，且須特別對準(zhǔn)中心，一些暗視野聚光鏡中央有一圓圈以幫助定位。先移去玻片，將該黑點或圓圈對于視野內(nèi)，換上玻騙且將聚光鏡接觸玻片下方，最后調(diào)整聚光鏡的焦距直到見到最佳的暗視野影響，即物體明顯顯示于黑的背景下。在缺乏暗視野聚光鏡的時候可將滴倍率物鏡對焦于玻片，接著將聚光鏡對準(zhǔn)該點，調(diào)整聚焦點為一視野內(nèi)的亮點，接著換上高倍率物鏡作最后調(diào)整，注意當(dāng)使用阿貝聚光鏡時需將光圈全打開以使周圍的光皆能通過，反射式暗視野并不適用光圈。

　　當(dāng)使用暗市也技術(shù)時須注意所有光學(xué)路徑必須維持干凈，任何額外的物質(zhì)會明顯影響影像。

　　2.6 反射鏡或上照明：

　　當(dāng)物體為不透明時需用反射式，使用低倍顯微鏡及一般配件即可，因低倍物鏡工作距離較�？梢怨恻c在樣本上對焦，這樣的照明可能會偏離光軸但可提供較佳的輪廓，當(dāng)需要用到較高倍率物鏡時便需用到柯勒照明，炫光通常會較穿透式嚴(yán)重故需小心調(diào)整，反射鏡安裝于后共焦面，在一些簡單的裝置上反光鏡可能只是簡單的玻璃，有十一個小的鏡片會裝于光軸上但會限制最大光圈，現(xiàn)代的設(shè)備會基于柯勒原理而使用一分光管或內(nèi)建的光學(xué)照明系列。

　　2.7 調(diào)整燈：

　　當(dāng)使用柯勒照明時燈式必須有一收集片，必須小心調(diào)整燈絲影像于聚光鏡的光圈，此時需暫時關(guān)上聚光鏡光圈。在一些內(nèi)建光源的顯微鏡可調(diào)整燈泡于光軸，如果沒有在燈泡后有鏡子及磨沙玻璃于集光鏡，可藉由放一磨沙玻璃或白卡至聚光鏡焦距上則可看到燈絲，該平面可輕易于聚光鏡處以一鏡子擺為45度時看見。

　　如果使用顯微鏡次座臺鏡作為外部光源之柯勒照明，燈絲的影像必須聚焦于聚光鏡光圈下方的燈室聚光鏡，利用一個小型的手持配鏡即可輕易看見。

　　2.8 設(shè)定來源聚焦光源

　　此方法通常用于顯微鏡裝有鏡子及外部光源，燈泡應(yīng)裝于具有限制燈泡面積的燈室，他可能是可具有可調(diào)之光圈組，且此光圈組需盡量靠近燈泡，燈泡本身則必須光線充足及均勻，并足以照明低倍率時的整個視野。一般所謂的珍珠燈泡則不適合，應(yīng)他會在視野中央形成 一亮點，用于放大相片用的乳白燈泡則非常適用。顯微鏡的設(shè)定步驟如下：

　　1. 調(diào)整燈泡和顯微鏡，將燈泡至于距離顯微鏡200-250mm，調(diào)整燈室角度并將光圈開至最大。

　　2. 放一適當(dāng)?shù)臉悠分劣^測臺，并使用10倍物鏡，通常此時不論光源是否有調(diào)整好，都應(yīng)該有足夠的光。

　　3. 調(diào)整顯微鏡的鏡子及燈泡至最佳亮度

　　4. 緩慢移動鏡子，會看見模糊的視野邊緣，接著調(diào)整聚光鏡直至邊緣影像清晰，因為典型的阿貝聚光鏡的消色差能力不佳，有可能會見到光暈，如果場光圈不適當(dāng)則可能要調(diào)整燈泡聚焦至樣本平面，一筆尖放置燈泡表面可幫助對焦。

　　5. 減小光圈至光源指照亮樣本。

　　6. 調(diào)整聚光鏡下的光犬以取得適當(dāng)工作光圈。

　　7. 如果必要可跳整鏡面角度，使用強(qiáng)度率光鏡及彩色率光鏡。

　　2.9提高對比

　　雖我們已經(jīng)強(qiáng)調(diào)過了一個影像的處里是否能夠清楚取決于有沒有足夠的對比是很重要的所以在這一章節(jié)我們將介紹對比對于光學(xué)顯微技術(shù)是很重要的就像darkground,phase contrast ,differential interference contrast ,等技術(shù)都是為了提高對比而發(fā)展出來的技術(shù)詳細(xì)的說明在Bradbury Evennett(1996)有詳細(xì)說明若我們有一個對比不高的樣品我們要用簡單的方法來提高對比若我們有一個物鏡他有自然的顏色或有被染色過就可以用濾鏡來加強(qiáng)對比若有一張黑白照片我們一用濾鏡去補(bǔ)償?shù)脑捑涂梢蕴岣邔Ρ扔秩缫粯悠肺覀儼阉�染紅綠色在經(jīng)過綠濾鏡補(bǔ)償之后紅色部分就會變的很暗反之原理亦相同寬帶的時域穿透率竟是用玻璃或塑料做成的其它重要的濾鏡如color correction filter,neutral filter,heat fitter color correction filter用來抑制鎢燈所產(chǎn)生的紅黃的過剩光線light blue filter有時可利用他來用肉眼去看會更清楚nd filter是用來衰減強(qiáng)度的若必須要用高功率的光源這一個濾鏡就是最常用的率降來衰減強(qiáng)度用的千萬不要只靠著關(guān)閉孔鏡或改降低光員工率若高強(qiáng)度的燈如鎢鹵素?zé)魟t熱濾鏡就會被用到他可以用來吸收由樣品所生的紅外放射光

　　2.10

　　當(dāng)有一個影像差的情形出現(xiàn)時照著7.2來操作就可以改善

　　2.11儀器的注意

　　再顯微鏡的儀器通常是貴重的所以再舉起時均要小心并且保持儀器在最好的狀態(tài)如何保護(hù)儀器通常預(yù)防好于治療千萬不可以用不是當(dāng)?shù)穆萁z起子再移動物鏡或目鏡時均要注意是否會撞到平臺或其它東西。