流式細(xì)胞儀技術(shù)概述

流式細(xì)胞儀技術(shù)，主要是測(cè)量群體中單個(gè)細(xì)胞經(jīng)適當(dāng)染色后其成分所發(fā)出的散射光和熒光，經(jīng)染色的細(xì)胞在懸液中以單行流過(guò)高強(qiáng)度光源的焦點(diǎn)，當(dāng)每個(gè)細(xì)胞經(jīng)過(guò)焦點(diǎn)時(shí)，發(fā)出一束散射光/或熒光。它們經(jīng)過(guò)過(guò)濾及光鏡系統(tǒng)收集到達(dá)一個(gè)光電檢測(cè)器(光電倍增管或一個(gè)固態(tài)裝置)，光檢測(cè)器把散射光定量轉(zhuǎn)化成電信號(hào)，經(jīng)數(shù)字轉(zhuǎn)換器進(jìn)行數(shù)字化后而成整數(shù)，然后進(jìn)行電子存儲(chǔ)，以后數(shù)據(jù)可以調(diào)出顯示和進(jìn)行分析。其優(yōu)點(diǎn)如下：

1、具有操作簡(jiǎn)便，只要將染色的單個(gè)細(xì)胞推入儀器中，就會(huì)得出數(shù)據(jù)。

2、具有較高的靈敏度及測(cè)定速度，而且每次可測(cè)出許多數(shù)據(jù)，一般情況下，每秒可測(cè)5000個(gè)細(xì)胞，能迅速分析和記數(shù)大量細(xì)胞，并能準(zhǔn)確統(tǒng)計(jì)群體中熒光標(biāo)記細(xì)胞的比例。

3、應(yīng)用廣泛，即可用于測(cè)定細(xì)胞活力、繁殖周期和細(xì)胞定型分析，也可區(qū)別死亡細(xì)胞、分裂細(xì)胞和靜止細(xì)胞群，既可測(cè)定DNA和RNA、測(cè)凋亡峰，又可測(cè)蛋白含量，特別是胞漿蛋白。

一、樣品的制備

流式細(xì)胞儀是測(cè)定一個(gè)或重復(fù)的每個(gè)顆粒經(jīng)光路的信號(hào)，因此，細(xì)胞必須做成單個(gè)細(xì)胞懸浮狀態(tài)，不能聚集，也不允許有細(xì)胞碎片存在。所用染料必須特異(如特異單抗)，而且不允許滲透至載液中。

標(biāo)本如果是屬于淋巴細(xì)胞等血細(xì)胞、骨髓細(xì)胞或白血病細(xì)胞系或類淋巴細(xì)胞系，要經(jīng)Ficoll分離，作單細(xì)胞分離處理，但若為實(shí)體組織或貼壁生長(zhǎng)的上皮成纖維樣細(xì)胞，需采用酶消化法(胰蛋白酶、膠原酶等)，化學(xué)法(EDTA、EGTA和檸檬酸鹽)消化分散液或洗液最好用無(wú)鈣、鎂PBS，檸檬酸鹽的濃度為40μmol/L，并同時(shí)采用機(jī)械分散法，將經(jīng)消化處理的膨松組織，用玻璃珠懸搖或用吸管吹打分散均可，用PBS洗2～3次后重懸，最好過(guò)一下尼龍或不銹鋼網(wǎng)篩100μm和20μm。細(xì)胞濃度要保證在1～2×106/ml。

若標(biāo)本用于測(cè)定單個(gè)細(xì)胞，需加入1～5mg/L的DNAase，將有助于阻止破碎細(xì)胞釋放的DNA造成細(xì)胞再聚集，但是若分離的細(xì)胞要作DNA含量測(cè)定之用時(shí)，則切勿加DNAase。

二、懸浮細(xì)胞的固定

上述制備的活細(xì)胞即可用于流式細(xì)胞儀分析，如果染色和流式分析要拖后進(jìn)行，或?yàn)榱颂岣呷旧�效果，則要將細(xì)胞預(yù)固定。乙醇固定是常用的方法。

1、固定方法：

(1)甲醛法：在細(xì)胞懸液中加入等量的8%甲醛(用Hank’S液配)4℃下固定12～18小時(shí)。

(2)乙醇法：細(xì)胞懸于PBS中，緩慢加入-20℃預(yù)冷的95%乙醇，使終濃度為70%，冰浴30分鐘。

(3)丙酮法：于細(xì)胞懸液中，緩慢加入冷丙酮，使終濃度為85%。

2、實(shí)例：

(1)用預(yù)冷的無(wú)鈣、鎂含0.5mmol/L EDTA的磷酸鹽緩沖液，將細(xì)胞制成1×106細(xì)胞的懸液。

(2)在4℃下逐滴加入3倍體積的95%乙醇，連續(xù)攪拌使乙醇終濃度達(dá)70%。

(3)該細(xì)胞可在4℃下保存數(shù)日。

(4)分析前先用1000r/min離心10分鐘，棄去乙醇，再將細(xì)胞懸于PBS中或要求的試劑中。

三、流式細(xì)胞儀分析的應(yīng)用

(一)非染色細(xì)胞的光散射

一個(gè)粒子(如細(xì)胞)出現(xiàn)在一束光線中，立即會(huì)干擾該光束，造成該光束入射光的重分布，該細(xì)胞所獲能量則以衍散、折射、反射等復(fù)雜的參數(shù)形式重新發(fā)射出來(lái)，這些參數(shù)與細(xì)胞體積、表面構(gòu)象、內(nèi)部結(jié)構(gòu)形成函數(shù)關(guān)系，可測(cè)低角前面約10°的光散射及90°的光散射。

一般認(rèn)為，90°位置的光散射值主要受細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)所致的光反射和折射影響，而低角前面10°位置的光散射則主要代表細(xì)胞大小。光散射測(cè)量方法如下：

(1)將細(xì)胞懸浮于HBSS中，濃度介于1×106～2×106/ml濃度之間。

(2)以懸浮細(xì)胞平衡鹽溶液(HBSS)充滿含鞘液的細(xì)胞貯藏池。

(3)設(shè)定細(xì)胞流量為500個(gè)/S(秒)，以獲得最佳測(cè)定結(jié)果。

(二)染色法

1、細(xì)胞的碘化丙錠(propiolium iodide，PI)染色

PI和EB(溴化乙錠)為同類物質(zhì)，與EB一樣，PI嵌入DNA雙螺旋中，可使熒光強(qiáng)度增加約20倍，PI的熒光強(qiáng)度約為EB染色的1.8倍，以488nm波長(zhǎng)激發(fā)，DNA/PI復(fù)合物最大的發(fā)射波長(zhǎng)約為615nm。

1.1 小鼠Lewis肺癌細(xì)胞(3LL)DNA含量測(cè)定方法

(1)從C57BL/6小鼠上切除腫塊，在培養(yǎng)皿內(nèi)用PBS沖洗;

(2)去除結(jié)締組織及脂肪，剪碎腫塊;

(3)小碎片移入1.20×38mm注射針，加壓使其通過(guò)，于4℃條件下重懸細(xì)胞于HBSS中。

(4)將200～300μL細(xì)胞懸液(5×105細(xì)胞/ml)中加入3ml PI(50μg/ml)，染色3LL細(xì)胞，于4℃存放20～30分鐘。

(5)測(cè)定580～750nm之間的發(fā)射熒光，以去除末結(jié)合PI產(chǎn)生的激發(fā)光與發(fā)射光譜線之間的重疊部分。

注：PI染色液：0.1%檸檬酸鈉1000ml+PI5mg+1%Nonide P40水。

1.2 培養(yǎng)細(xì)胞DNA的流式細(xì)胞儀分析

(1)從培養(yǎng)皿中吸去培養(yǎng)基，以HBSS沖洗二次;

(2)加入PI5ml于培養(yǎng)皿中，在4℃放10分鐘;

(3)用吸管反復(fù)次打細(xì)胞，使細(xì)胞破壞，胞核釋放出來(lái)，再行流式細(xì)胞儀分析。

1.3 完整細(xì)胞DNA的PI染色

(1)70%乙醇固定的細(xì)胞懸液，離心，去固定液;

(2)室溫條件下加入PI染色一批細(xì)胞(105～106細(xì)胞/ml)，時(shí)間為30分鐘，然后行流式細(xì)胞儀分析。

1.4 光輝霉素和PI的DNA染色

在熒光抗生素光輝霉素和PI聯(lián)合染色過(guò)程中，光輝霉素的供體分子被PI的受體分子接受產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移，該染色技術(shù)主要用于實(shí)體腫瘤組織，精子細(xì)胞及婦科標(biāo)本，同時(shí)也適用于體外培養(yǎng)的細(xì)胞。

(1)分離制備的細(xì)胞懸液即可使用，若用70%乙醇固定可保存一周。

(2)以PI/光輝霉素染色，4℃1小時(shí)(PI為10mg/L、光輝霉素為10mg/L)。

(3)染色后進(jìn)樣，以100W汞燈作為激光光源，使用BG123nm阻斷濾片，疊加K590型高通濾法(one seep filter)。

2、DNA和RNA的鑒別染色

利用吖啶橙的變色特性可鑒別DNA和RNA。吖啶橙作為一種熒光染料已被用于染色固定，非固定細(xì)胞核酸，或作溶酶體的一種標(biāo)記。觀察死亡細(xì)胞熒光變色性變化以及區(qū)別分裂細(xì)胞和靜止細(xì)胞群體。雖然測(cè)定DNA和RNA含量時(shí)較難獲得好的重復(fù)性結(jié)果，但該方法已被許多實(shí)驗(yàn)室廣泛采用。方法如下：

(1)試劑：

溶液A：低溫保存，穩(wěn)定期約2周。

Triton X-100(0.1%0.1ml，1mol/LHCL 8ml

1mol/LNaCI15ml蒸餾水76ml，PH1.5(100ml)

溶液B：穩(wěn)定期數(shù)月，最好除菌以后(高壓或過(guò)濾)貯存。

0.01mol/LEDTA10ml，1mol/LNaCI15ml

0.4mol/LNa2HPO4 31.5ml，0.2mol/L檸檬酸18.5ml

蒸餾水24ml，總體積為99ml，pH6.0

吖啶橙母液：

用吖啶橙/蒸餾水配成1mg/mL(致癌物，應(yīng)小心)，吖啶橙應(yīng)用液0.1ml母液加9.9ml溶液B稀釋。

注意：儀器鞘流系統(tǒng)應(yīng)保持4℃。

氬激光激發(fā)波488nm，紅色熒光為DNA(F>600nm)，綠色熒光為RNA或單鏈DNA(F>530nm)

(2)方法

①用含15%血清的PBS配制細(xì)胞懸液，取0.2ml(8×106細(xì)胞/ml)，加入0.4ml溶液A，4℃放置45～60秒。

②加1.2ml含吖啶橙的溶液B，室溫2分鐘。

③應(yīng)在加入溶液B后10分鐘內(nèi)進(jìn)流式細(xì)胞儀分析。

注意：①細(xì)胞數(shù)保持恒定;②核酸與吖啶橙的比例;③染色時(shí)間及溫度。

(三)染色法的應(yīng)用

1、變性及雙鏈DNA的鑒別染色

(1)試劑：

HBSS內(nèi)含1000u/ml RNA酶A，0.2mol/LKCl，pH1.35

吖啶橙用0.1mol/L檸檬酸配成5mg/L(16.7μm)，0.2mol/L Na2HPO4 緩沖液，pH2.6。

①2×106細(xì)胞懸于1mlHBSS/RNase液中。

②37℃溫育1小時(shí)。

③將0.2ml細(xì)胞懸液(含4×105細(xì)胞始終懸浮于HBSS/RNase)與0.5ml0.2mol/L KCl(pH1.35)混勻，20℃ 30分鐘。

④加2ml吖啶橙染色2分鐘。

⑤綠色熒光(530nm)和紅色熒光(600nm)分別代表細(xì)胞中單鏈及雙鏈DNA含量。

2、DNA與癌基因探針雙標(biāo)記測(cè)定

這種測(cè)定是先用癌基因探針按間接免疫熒光染色法標(biāo)記癌基因表達(dá)產(chǎn)物，然后用PI標(biāo)記DNA，現(xiàn)以研究白血病細(xì)胞增殖與癌基因的關(guān)系說(shuō)明操作步驟：

(1)制備白血病細(xì)胞懸液，用100%甲醇在-20℃固定10分鐘。

(2)取50μl50mg/L的癌基因探針Y13-25(它是一種廣譜單克隆抗體，可特異性地直接與N-ras，Ki-ras和Ha-ras三種癌基因編碼的21Kd蛋白相結(jié)合)，4℃作用30～45分鐘。

(3)用PB離心洗滌2次，重懸浮于50μlHBSS中(含0.1%疊氮鈉和2%小牛血清)。

(4)加入50μl1：200兔抗鼠IgG，4℃放置30～45分鐘。

(5)同(3)洗滌后加入50μl1：40的FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG，4℃反應(yīng)30～45分鐘。

(6)同(3)洗滌后，細(xì)胞用RNA酶消化，室溫20～30分鐘。

(7)同(3)洗滌后，用PI染液染20分鐘。

(8)同(3)洗滌后，用488nm激發(fā)波長(zhǎng)測(cè)定。FITC染色顯示ras癌基因表達(dá)產(chǎn)物，PI染色顯示DNA含量。

注意事項(xiàng)：

①制備樣品時(shí)，離心次數(shù)不宜過(guò)多，防止細(xì)胞丟失和凝集;

②細(xì)胞固定時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，不要用冰醋酸、乙醇、苦咪酸及汞固定劑;

③為了降低本底，應(yīng)將細(xì)胞表面未結(jié)合的熒光染料洗凈;

④進(jìn)行雙標(biāo)記沉淀時(shí)，應(yīng)盡量選用激發(fā)光譜不接近的熒光色素。

3、以溴化脫氧尿嘧啶(Brdu)和Hoechst33258染料進(jìn)行細(xì)胞周期分析

(1)試劑：

用培養(yǎng)基配制33mg/LBrdu及脫氧細(xì)胞苷26.4g/ml。

染色液：Hoechst33258溶于PBS，細(xì)胞染色24小時(shí)后進(jìn)行分析，據(jù)報(bào)道染色的穩(wěn)定時(shí)間在30分鐘至24小時(shí)之間。

(2)方法：

①將Brdu溶液按1：10加入細(xì)胞培養(yǎng)液中。

②根據(jù)細(xì)胞周期時(shí)間不同，選擇不同時(shí)間培養(yǎng)的細(xì)胞。

③孵育后，搖散細(xì)胞以傳代培養(yǎng)。

④直接用染液重懸細(xì)胞，進(jìn)入流式細(xì)胞儀分析。

Hoechst33258熒光值在410～580nm之間，需用330～360nm紫外光激發(fā)。應(yīng)特異性結(jié)合腺嘌呤-胸腺嘧啶堿基對(duì)。因此，不僅特異性標(biāo)記DNA，亦可標(biāo)記胸腺嘧啶。在細(xì)胞周期分析時(shí)，在與細(xì)胞孵育過(guò)程加入Brdu，Brdu可替代DNA中的胸腺嘧啶，因此，處于合成期內(nèi)的細(xì)胞表面上仍保持二倍體狀態(tài)，并在分裂后G1峰的半峰處產(chǎn)生一新峰，此項(xiàng)技術(shù)可用于直接測(cè)定細(xì)胞G2期及分裂時(shí)間。

4、Hoechst33342染色活細(xì)胞DNA

(1)試劑：Hoechst 33342，用蒸餾水配成0.25mol/L。

(2)方法：

①制備106/ml細(xì)胞懸液，以Hoechst33342染色，濃度為5～10mg/L ，室溫下20分鐘。

②分析前切勿洗滌細(xì)胞。

Hoechst33342可用作細(xì)胞DNA的活體染料，據(jù)信可在保持細(xì)胞活性的同時(shí)，呈現(xiàn)出相當(dāng)好的DNA化學(xué)計(jì)量關(guān)系，激發(fā)波在紫外范圍350～363nm之間，發(fā)射波則在450nm處。

5、以異硫氰酸熒光素(Fluorescein Isothiocyante FIFC)染色蛋白質(zhì)。

(1)試劑：異硫氰酸熒光素(FIFC)用含40mg/LRNase的PBS配成0.1～1.0mg/L濃度。

(2)方法：

①染色前用終濃度70%乙醇固定細(xì)胞，至少18小時(shí)。

②離心固定細(xì)胞，棄去固定液。

③室溫下用FIFC染色細(xì)胞蛋白，30分鐘。

④流式細(xì)胞儀分析，使用氬激光，激發(fā)波長(zhǎng)488nm，熒光發(fā)射波長(zhǎng)515～535nm。

也可于固定細(xì)胞中，以18mg/L(0.1%檸檬酸鹽配制)和0.05mg/L FIFC(含40 mg/L RNase，PBS配制)染色20分鐘以上可對(duì)DNA和蛋白質(zhì)雙重染色，分別呈現(xiàn)紅色熒光(DNA)和綠色熒光(蛋白質(zhì))。

6、熒光素抗體的應(yīng)用

該技術(shù)既可用于檢測(cè)帶有特異性膜抗原的細(xì)胞，可用熒光素或若丹明標(biāo)記單克隆抗體處理上述細(xì)胞;也可用于測(cè)定胞漿中的蛋白質(zhì)(如凋亡BCL-2蛋白，抗病毒蛋白MXA等)。

用磷酸鹽緩沖液Eagle’s MEM稀釋FIFC連接的抗體內(nèi)含0.1%疊氮鈉、2%牛血清。為判定FIFC抗體的最適度的稀釋濃度，向微量滴定板的細(xì)胞中加入50μl不同濃度的稀釋液，再以熒光顯微鏡確認(rèn)最佳染色濃度。使用抗人LEU-I抗體分析時(shí)，應(yīng)稀釋成5mg/L或0.25mg/L。無(wú)論鼠或人細(xì)胞在2×107濃度時(shí)其存活率應(yīng)在90%以上。

方法：

(1)于微量滴定板加入50μl抗體稀釋度，再加入50μl細(xì)胞懸液，混勻。

(2)冰浴45分鐘，離心滴定板(1500r/min10分鐘)。

(3)棄上清，以培養(yǎng)基100μl洗滌細(xì)胞沉淀2次，每次洗滌后用1500r/min10分鐘，棄上清。

(4)以1ml預(yù)冷的培養(yǎng)基配成1×106細(xì)胞/ml的已染色細(xì)胞懸液，進(jìn)樣前持續(xù)保持冷環(huán)境(4℃)。

目前流式細(xì)胞儀(FCM)已在各學(xué)科中獲得應(yīng)用。

①細(xì)胞生物學(xué)：定量分析細(xì)胞周期并分選不同細(xì)胞周期時(shí)相的細(xì)胞;分析生物大分子如DNA、RNA、抗原、癌基因表達(dá)產(chǎn)物等物質(zhì)與細(xì)胞增殖周期的關(guān)系，進(jìn)行染色體核型分析，并可純化X或Y染色體。

②腫瘤學(xué)：DNA倍體含量測(cè)定是鑒別良、惡性腫瘤的特異指標(biāo)。近年來(lái)已應(yīng)用DNA倍體測(cè)定技術(shù)，對(duì)白血病、淋巴瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多種實(shí)體瘤細(xì)胞進(jìn)行探測(cè)。用單克降抗體技術(shù)清除血液中的腫瘤細(xì)胞。

③免疫學(xué)：研究細(xì)胞周期或DNA倍體與細(xì)胞表面受體及抗原表達(dá)的關(guān)系;進(jìn)行免疫活性細(xì)胞的分型與純化;分析淋巴細(xì)胞亞群與疾病的關(guān)系;免疫缺陷病如艾滋病的診斷;器官移植后的免疫學(xué)監(jiān)測(cè)等。

④血液學(xué)：血液細(xì)胞的分類、分型，造血細(xì)胞分化的研究，血細(xì)胞中各種酶的定量分析，如過(guò)氧化物酶、非特異性酯酶等;用NBT及DNA雙染色法可研究白血病細(xì)胞分化成熟與細(xì)胞增殖周期變化的關(guān)系，檢測(cè)母體血液中Rh(+)或抗D抗原陽(yáng)性細(xì)胞，以了解胎兒是否可能因Rh血型不合而發(fā)生嚴(yán)重溶血;檢測(cè)血液中循環(huán)免疫復(fù)合物可以診斷自身免疫性疾病，如紅斑狼瘡等。

⑤藥物學(xué)：檢測(cè)藥物在細(xì)胞中的分布，研究藥的作用機(jī)制，亦可用于篩選新藥，如化療藥物對(duì)腫瘤的凋亡機(jī)制，可通過(guò)測(cè)DNA凋亡峰，Bcl-2凋亡調(diào)節(jié)蛋白等。